اثر نانوذرات نقره سنتزشده زیستی بر ویژگی‌های رشدی و محتوای فلاونوئید گیاه گندم (Triticum aestivum)

مقدمه

نانوذرات به ذراتی به ابعاد 1 تا 100 نانومتر گفته می شود (Ostiguy and Roberge, 2010). به دلیل خواص و ویژگی های جدیدی که نانوذرات دارند، تمایل بسیار زیادی به کاربرد آن ها در زمینه های کشاورزی، صنایع و پزشکی وجود دارد (Kim et al., 2004). معمولا نانوذرات با روش های مختلف مصنوعی سنتز می شوند. برخی از روش های مصنوعی عبارتند از: روش های احیا، سل-ژل،  و الکتروشیمیایی (Sundrarajan and Gowri, 2001). در روش های مصنوعی از مواد خطرناک مانند حلال های آلی و عوامل سمی احیا کننده مانند سدیم تترا هیدروبورات وان- ان دی متیل فرمامید استفاده می شود (Bhattacharya and Gupta, 2005). با توجه به استفاده فراوان نانوذرات و برای به حداقل رساندن استفاده از مواد مضر زیست مجیطی، سنتز نانوذرات با استفاده از روش زیستی پیشنهاد شده است (Mohanpuria et al., 2008). بهترین روش سنتز زیستی نانوذرات توسط عصاره گیاهان می باشد (Shankar et al., 2004., Khatami. and Pourseyedi, 2015) . روش سنتز زیستی نانوذرات توسط عصاره گیاهان دارای مزایای متعدد در زمینه دارویی و دیگر برنامه های کاربردی پزشکی می باشد و به عنوان یک جایگزین ساده برای روش های پیچیده فیزیکی و شیمیایی است. بنابراین ما در این تحقیق از گیاه آلوئه ورا برای سنتز نانوذرات نقره استفاده کردیم. آلوئه ورا،گیاهی دارویی می باشد که دارای خواص درمانی گوناگونی از جمله بهبود زخم، ترمیم آسیب های ناشی از تابش پرتوها، ضد التهاب، ضد ویروسی، باکتری و قارچ است (Choi and Chung, 2003). از طرف دیگر، نانوذرات به دلیل اثرات خاص و ویژگی های منحصر به فردشان ورود گسترده ای به دنیای پزشکی، دارویی، صنعت و کشاورزی داشته اند (Oberdorster etal., 2005). این ذرات به اشکال مختلف در محیط زیست آزاد شده و تاثیرات ناشناخته آنها بر گیاهان و اکوسیستم، موجبات نگرانی های بسیاری را فراهم آورده است. Krishnarj و همکاران در سال 2012، اثر نانوذره نقره سنتز شده زیستی را روی رشد گیاه باکوپا مطالعه کردند و مشاهده کردند که نانوذرات نقره اثر مثبتی روی جوانه زنی دانه و القا سنتز پروتئین و کربوهیدرات دشته ولی محتوای فنل کل و فعالیت آنزیم کاتالاز و پراکسیداز را کاهش داده است. تحقیقات دیگری که توسط Yin و همکاران در سال 2011 انجام گرفت مشاهده شد که نانوذرات نقره، رشد گیاه چمن لولیوم را کاهش داده اند.

از طرف دیگر، اصلی ترین مشکلات اقتصادی جوامع در حال توسعه، تأمین غذا  است و در این رابطه غلات و به ویژه گندم اهمیت بیشتری دارند. گندم در الگوی مصرف و در الگوی تولیدات کشاورزی جهان نقش حیاتی دارد .(Martin et al., 1998) بنابراین هدف این پژوهش سنتز نانوذرات نقره از عصاره گیاه آلوئه ورا و تاثیر آن بر روی رشد و رنگیزه های فلاونوئید گندم است.

مواد و روشها

این تحقیق با هدف تولید نانوذره نقره توسط عصاره آلوئه ورا و اثر نانوذره نقره و نقره بر ویژگی های رشدی و محتوای فلاونوئید گیاه گندم در دانشگاه شهید باهنر کرمان در سال 1391 اجرا شد. برای شروع پژوهش ابتدا عصاره آلوئه ورا برای تولید نانوذرات نقره تهیه شد.

تهیه عصاره برای تولید نانوذرات نقره

برای تهیه عصار ه برگ آلوئه ورا، ابتدا برگ های آلوئه ورا از گلخانه دانشگاه شهید باهنر کرمان جمع آوری شدند. سپس، برگ های آلوئه ورا در آزمایشگاه (دمای 23 درجه سانتی گراد) دانشگاه شهید باهنر کرمان 2 بار با آب مقطر شسته شدند. 30 گرم برگ تر آلوئه ورا وزن شده و به قطعات کوچک ریز شدند. قطعات در داخل یک ارلن ریخته وبا آب مقطر به حجم 100میلی لیتر رسانده شده و سپس به مدت 5 دقیقه جوشانده و عصاره حاصل از آن ها پس از  سرد شدن، توسط کاغذ صافی صاف شد. 80 سی سی از عصاره به بشر حاوی عصاره، نمک نیترات نقره با غلظت 20 میلی مولار افزوده شد. مخلوط واکنش یک ساعت  در دمای آزمایشگاه قرار گرفت و بعد از یک ساعت  رنگ عصاره از زرد کم رنگ به قهوه ای تیره که نشان دهنده تولید نانو ذرات نقره بود، تغییر یافت. سپس توسط دستگاه اسپکتروفوتومتری UV-Visible (مدل Cary 50) از محلول ها برای سنجش طیف استفاده شدند. برای تعیین اندازه نانوذرات توسط پراش پودری پرتو ایکس (X-Ray Diffraction)، محلول ها به مدت 3 روز در دمای آزمایشگاه قرار گرفته تا کاملا خشک شود  و برای آنالیز استفاده شدند.

آنالیزاسپکتروفوتومتریUV-Visible

برای آنالیز اسپکتروفوتومتری UV-Visible، جذب محلول قهوه ای تیره  رنگ ( عصاره  حاصل از برهمکنش عصاره گیاهی آلوئه ورا و نمک نقره) و محلول زرد رنگ (عصاره)، با استفاده از دستگاه اسپکتروفوتومتری در بازه طول موج  400-600 نانومتر بررسی شد (Huang et al., 2007).

اندازه نانوذراتنقره بهکمکپراشپودریپرتوایکس (XRD)  

اندازه متوسط ذرات با استفاده از معادله شرر مشخص شد که در آن β پهنای طیف در نصف ارتفاع ماکزیمم میباشد و افزایش آن مبین کوچکتر شدن ابعاد ذرات  پودری است.(Sadowski et al.,2008)

معادله شرر..........

تیمار نانوذرات نقره روی گندم

بعد از تهیه نانوذرات نقره ، برای خالص سازی نانوذرات، پودر نانوذرات 3 بار با آب مقطر به مدت 10 دقیقه در ×g 2000 سانتریفوژ شدند و محلول رویی دور ریخته شد و محلول زیرین در دمای آزمایشگاه به مدت 3 ساعت خشک شد و برای تیمار نانوذرات نقره بر گندم استفاده شدند. گیاه مورد آزمایش در این پژوهش گیاهگندم aestivum)Triticum) رقم پیشتاز می باشد.  ابتدا بذرهای گندم با هیپوکلریت سدیم 5/0 درصد  برای 6 دقیقه ضدعفونی شده و سپس بخوبی با آب مقطر دو بار شسته شد. دانه ها در گلدان های حاوی پرلیت قرار داده شد و به مدت یک هفته با محلول غذایی هوگلند آبیاری شد. بعد از این مدت محلولهای نانوذره نقره که قبلا آلتراسونیک شده در غلظت های (0، 40، 80 پی پی ام) و نیترات نقره در غلظت های (0، 40، 80 پی پی ام) به محلول غذایی هوگلند اضافه شدند. بعد ازدو هفته گیاهان برای سنجش وزن تر ریشه و ساقه و فلاونوئیدها برگ گندم برداشت شدند.

فلاونوئیدها

اندازه‌گیری فلاوونوئید‌ها به روش اسپکتروفتومتری با استفاده‌از روش Krizek و همکاران (1998) انجام گرفت. 1/0 گرم از برگ گیاه در ‌ها‌ون چینی با 10 میلی‌لیتر اتانول اسیدی (الکل اتیلیک و اسید استیک گلاسیال به نسبت حجمی‌1:99) ساییده شده و به مدت 15 دقیقه در ×g 2000 سانتریفوژ شدند و محلول رویی به‌مدت ده دقیقه در حمام آب گرم با دمای 80 درجه سانتی‌گراد قرار گرفت. شدت جذب در طول موج های 270،  300و 330 نانومتر خوانده شد. نتایج بر حسب درصد جذب گزارش گردید.

Flavonoid= ABS (V/700 × 100)

V: حجم عصاره

تجزیهوتحلیلآماری

این تحقیق در قالب طرح کاملاً تصادفی با تعداد 3 تیمار و هر تیمار 4 تکرار انجام شد. آنالیز داده ها با استفاده از نرم افزار آماری SPSS و آزمون ANOVA صورت گرفت. مقایسه میانگین ها با استفاده  از آزمون دانکن در سطح احتمال 5 درصد و رسم نمودارها با استفاده از نرم افزار Excel صورت پذیرفت .

نتایج

نتایج سنتر نانوذرات نقره

تغییررنگ عصاره

شکل(1)، تغییر رنگ، برهم کنش عصاره گیاهی آلوئه ورا و محلول نمک نقره را نشان می دهد که این تغییر رنگ از زرد کم رنگ (رنگ عصاره قبل از اضافه کردن نیترات نقره) به قهوه ای تیره (رنگ عصاره بعد از اضافه کردن نیترات نقره) می باشد.

آنالیزاسپکتروفوتومتریUV-Visible

برای آنالیز اسپکتروفوتومتریUV-Visible، جذب محلول زرد رنگ (عصاره) و محلول قهوه ای رنگ (عصاره+نیترات نقره) حاصل از برهمکنش عصاره گیاهی آلوئه ورا و نمک نقره ، با استفاده از دستگاه اسپکتروفوتومتری در بازه طول موج  400-600 نانومتر بررسی شدند (شکل2). با توجه به  شکل 2، ماکزیمم جذب در حدود طول موج 460 نانومتر در محلول قهوه ای تیره  رنگ مشاهده می شود که در عصاره این پیک جذبی وجود ندارد. این ماکزیمم پیک جذب در حدود طول موج 460 نانومتر نشان دهنده وجود نانوذرات نقره و در واقع تولید نانوذرات توسط عصاره است.

اندازه نانوذراتنقره بهکمکپراشپودریپرتوایکس (XRD)  

شکل (3) پراش پرتو X نانوذرات نقره را نشان می دهد. نانوذرات نقره دارای صفحات کریستالی (111)، (200) و (311) می باشند و با استفاده از معادله شرر، ابعاد نانوذرات  حاصل  توسط عصاره آلوئه ورا 25 نانومتر می باشد.

نتایج اثر نانوذرات نقره بر گندم

اثر نانوذرات نقره بر رشد گندم

همانطور که در شکل 4 و5 مشاهده می شود، با افزایش غلظت نقره و نانوذرات نقره وزن تر ریشه و ساقه افزایش می یابد و این افزایش در تیمار نانوذره نقره نسبت به نقره چشمگیرتر است. ماکزیمم وزن تر ریشه و ساقه مربوط به غلظت  80 پی پی ام نانوذرات نقره می باشد.

اثر نانوذرات نقره بر رنگیزه های فلاونوئید گیاه گندم

همانطور که در شکل 6 مشاهده می شود، تیمار نقره و نانوذرات نقره بر محتوای رنگیزه فلاونوئید در طول موج 270 نانومتری تاثیر معنی داری نداشته، اما بر محتوای رنگیزه  فلاونوئید در طول موج 300 و 330 نانومتر تاثیر افزایشی داشته است. بالاترین محتوای رنگیزه  فلاونوئید در طول موج 300 و 330 نانومتر مربوط به غلظت نقره 80 پی پی ام می باشد.

بحث

نانو ذرات در زمینه های کشاورزی، صنایع و پزشکی کاربردهای فراوانی دارند .(Kim et al., 2004) امروزه، سنتززیستی نانو ذرات با استفاده از عصاره گیاهان، توجه بسیاری از دانشمندان را به خود جلب کرده است. بنابراین هدف این پژوهش، سنتز نانوذرات نقره  توسط عصاره گیاه آلوئه ورا و اثر این نانوذرات بر گندم بود. در اثر برهم کنش عصاره گیاهی آلوئه ورا و محلول نمک نقره تغییر رنگی مشاهده  شد که این تغییر رنگ از زرد کم رنگ (رنگ عصاره قبل از اضافه کردن نیترات نقره) به قهوه ای تیره (رنگ عصاره بعد از اضافه کردن نیترات نقره) بود. نتایج حاصل از این پژوهش با تحقیقات Reddy و Gandhi (2012)کاملا مشابه بود و اولین  نشانه از تولید نانوذرات نقره محسوب می شد. جذب نانوذرات نقره سنتز شده توسط آلوئه ورا با استفاده از دستگاه اسپکتروفتومتری UV-Visible، ماکزیمم جذب در طول موج 460 نانومتر را نشان داد. زمانی که یک پرتو نوری به سطح نانوذرات فلزی بتابد، میدان نوسانی موج فرودی، موجب نوسان الکترون های رسانش فلز به صورت دسته جمعی می شود. این نوسان های دسته جمعی الکترون های رسانش، پلاسمون سطحی نامیده می شوند. پلاسمون سطحی نانوذرات یکنواخت دارای فرکانس شدیدی هستندکه در آن فرکانس بیشترین جذب و پراکندگی را از خود نشان می دهند (Willets and Duyne, 2007) . نتایج ماکزیمم جذب در طول موج 460 نانومتر با نتایج Sivaraman و همکاران ( 2009 ) و Sathyavathi و همکاران (2010) مشابهت داشت. در ادامه پژوهش، برای بررسی، اثر نانوذرات نقره زیستی و نقره بر ویژگی های رشدی و محتوای فلاونوئید برگ گیاه گندم، نانوذرات نقره و نقره  در غلظت های مختلف (0، 40، 80 پی پی ام) استفاده شدند. تیمار نقره در غلظت 80 پی پی ام و نانوذرات نقره در هر دو غلظت 40 و 80 پی پی ام باعث افزایش وزن تر ساقه و ریشه شدند. اما نانوذرات نقره اثر افزایشی چشمگیرتری داشت. مشابه با نتایج ما، Sharma و همکاران در سال 2012 گزارش کردند که تیمار نانوذرات نقره منجر به افزایش رشد گیاه خردل شده است. همچنین Amooaghaie و همکاران در سال 2015 که تیمار نانوذرات نقره منجر به افزایش رشد گیاه خردل سیاه شده است. Rezvani  و همکاران در سال 2012 گزارش کردند که نانوذرات نقره بدلیل بلوکه کردن مسیر سیگنالینگ اتیلن رشد گیاه زعفران را افزایش داده است. اثر نانوذرات نقره و نقره بر محتوای فلاونوئید گندم نشان داد ر تیمار نقره و نانوذرات نقره در هر دو غلظت 40 و 80 پی پی ام، محتوای فلاونوئید در طول موج 300 و 330 نانومتر را افزایش داد. Suriyaprabha  و همکاران در سال 2012، اثر نانوذرات را بر گیاه ذرت مطالعه کردند و گزارش کردند که نانوذرات اثر افزایشی بر محتوای فنل داشته است.

نتیجه گیری

بهترین روش سنتز زیستی نانوذرات توسط عصاره گیاهان می باشد و به عنوان یک جایگزین ساده برای روش های پیچیده فیزیکی و شیمیایی است. در این مطالعه نانوذرات نقره بوسیله نیترات نقره (20میلی مولار) با استفاده از عصاره برگ آلوئه ورا سنتز شد. تشکیل نانوذرات نقره با استفاده از اسپکتروفوتومتری UV-Visibleو پراش پودری پرتو ایکس شناسایی شد. سنتز نانوذرات نقره با ماکزیمم طول جذب در 460 نانومتر تایید شد. آنالیز پراش پودری پرتو ایکس نشان داد که اندازه نانوذرات نقره 25 نانومتر بودند. نتایج تیمارهای نانوذرات نقره زیستی و نقره در غلظت های مختلف بر گندم نشان داد که نانوذرات نقره و نقره در غلظت 80 پی پی ام وزن تر ساقه و ریشه را افزایش دادند. کاربرد نانوذرات نقره و نقره در غلظت 40 و 80 پی پی ام منجر به افزایش محتوای فلاونوئید طول موج 300 و 330 نانومتر شدند اما بر محتوای فلاونوئید طول موج 270 نانومتر اثری نداشتند.