ارزیابی تنوع ژنتیکی جمعیت های یونجه زراعی ). )Medicago sativa L با استفاده از تجزیه تشخیص کانونیکی

مقدمه

یونجه زراعی (Medicago sativa L.) در بین نباتات علوفه ای به علت کیفیت خوشخوراکی و غنی بودن از مواد پروتئینی و معدنی به عنوان مهمترین گیاه علوفه ای دنیا محسوب می شود (Tucak و همکاران، 2008). یونجه اهمیت زیادی در تغذیه دام ها و افزایش فرآورده های دامی دارد (Jafari و Goodarzi، 2007). یونجه زراعی (M. sativa) از گونه (M. coerulea) بومی جنوب غرب ایران و شرق آناتولی است و در بسیاری از منابع، مناطقی از ایران به عنوان مرکز تنوع و خاستگاه یونجه معرفی شده است (محمدی و همکاران، 1389). از طرفی افزایش تولید و بهبود کیفیت یونجه زراعی به استفاده موثر از تنوع منابع و بکارگیری آنها در برنامه های اصلاحی نیاز دارد و نیل به این هدف مستلزم حفاظت، ارزیابی، ثبت و تبادل این مواد است (رضایی و همکاران، 1389). بنابراین، بررسی تنوع ژنتیکی یونجه در این نواحی می تواند در پیشبرد اهداف فوق الذکر، مهم باشد. تنوع فنوتیپی وجود تفاوت فیزیکی قابل مشاهده در یک جمعیت می باشد و اجزای ژنتیکی و محیطی را شامل می شود. تفاوت های ژنوتیپی یکی از اجزای تنوع است که منجر به تنوع ژنتیکی میان افراد درون یک جمعیت یا بین جمعیت های درون یک گونه می شود و یکی از مهمترین نیازهای اصلاحگران می باشد. اساس فنوتیپ بر پایه صفات کمی و کیفی و به وسیله ترکیب ژنوتیپ و عکس العمل با  محیط می باشد (Loos، 1993). اگر مشاهدات فنوتیپی بر اساس اندازه کافی نمونه باشد و صفات فیزیکی اندازه گیری شده تفاوت های معنی داری بین ارقام نشان دهند، آنها می توانند نماینده واقعی از میزان تنوع ژنتیکی باشند (Humphreys، 1991).

تجزیه تشخیص کانونیکی روشی مرکب از تجزیه به مؤلفه های اصلی و تجزیه همبستگی کانونیک است (Vaylay و Van Santen، 2002). تجزیه تشخیص کانونیکی ترکیبات خطی صفات اصلی که بیشترین تفاوت را بین گروه ها فراهم می سازد، مشخص می کند (Dillon و Goldstein، 1984). متغیرهای کانونیکی ترکیبات خطی صفاتی هستند که دارای بیشترین همبستگی چندگانه با هر گروه می باشند. همچنین متغیر های کانونیکی حتی اگر صفات انداز ه گیری شده همبستگی بالایی با یکدیگر داشته باشند، با یکدیگر همبستگی ندارند. در تجزیه تشخیص کانونیکی، تفاوت گروه ها بر اساس همبستگی میان متغیر های مستقل (صفات اندازه گیری شده) و ارتباط آنها با متغیرهای وابسته (ارقام) می باشد (Vaylay و Van Santen، 2002). تجزیه تشخیص کانونیکی می تواند اثرات بین جمعیت ها را از اثرات درون جمعیت ها به وسیله حداکثر کردن تشخیص بین جمعیت ها زمانی که در مقابل تنوع درون جمعیت ها آزمون می شود، را جدا کند (Riggs، 1973). بعد از تعیین تنوع درون جمعیتی، آماره مربع فاصله ماهالانوبیس (D²) به عنوان یک شاخص که نشان دهنده تفاوت بین جمعیت هاست، استفاده می شود (Loos، 1993). همچنین این روش قادر است تنوع درون ارقام را که سبب اثرات محیطی و اثرات ژنتیکی است را جدا کند. این تشخیص به وسیله واریانس میان جمعیت ها به واریانس درون جمعیت ها به دست می آید (Rencher، 1992). از اطلاعات حاصل از تجزیه تشخیص کانونیکی می توان جهت گروه بندی توده ها و ارقام به زیر گروه های کوچکتر که شباهت زیادی درون آنها وجود دارد، استفاده نمود (Khattree و Naik، 2000). در واقع در استفاده از تجزیه کلاستر، تعیین مقدار شباهت درون گروهی و تعیین روشی برای تشکیل کلاسترها که بر پایه مقدار شباهت اندازه گیری شده است، لازم می باشد، اما در تجزیه تشخیص کانونیکی، اندازه گیری شباهت بطور مستقیم از متغیرهای کانونیکی محاسبه شده استفاده می شود. طوریکه مقدار میانگین متغیرهای کانونیکی به عنوان مراکز گروه ها تلقی می شوند (Yeater و همکاران، 2004). از روش های چند متغیره بر اساس صفات فنوتیپی، در سویا (Glycine max L.) (Bains و Sood، 1984)، لولیوم چند ساله (Lolium perenne L.) (Humphreys، 1991) و گونه های لولیوم (Loos، 1993) استفاده شده است.

 با توجه به اینکه هیچ گزارشی مبنی بر ارزیابی تنوع ژنتیکی جمعیت های مختلف یونجه زراعی با استفاده از تجزیه تشخیص کانونیکی ارائه نشده و از طرفی ارزیابی تنوع ژنتیکی بر مبنای صفات مورفولوژیک، فیزیولوژیک و زراعی می تواند برای سازماندهی ژرم پلاسم، گزینش والدین مناسب برای دورگ گیری و تولید جمعیت های در حال تفرق سودمند باشد (Foundra و همکاران، 2000) و همچنین بنابر آنچه از منابع مختلف بر می آید، با توجه به اینکه در یونجه تنوع مطلوب و قابل قبولی در ذخایر توارثی از نظر اکثر صفات موجود است، هدف این مطالعه ارزیابی تنوع ژنتیکی در جمعیت های مختلف یونجه زراعی بر اساس صفات فنوتیپی است.

مواد و روش ها

این آزمایش در مزرعه تحقیقاتی دانشکده کشاورزی دانشگاه ارومیه در سال زراعی 1390 در قالب طرح بلوک های کامل تصادفی با 3 تکرار روی هشت جمعیت مختلف قره یونجه ملک کندی، قره یونجه ارومیه، محلی اصفهانی، بغدادی، همدانی، آذربایجان اردوبار، ترکیه ساکوئل و ترکیه 1 اجرا شد (جدول 1). هر جمعیت در 5 خط 5 متری با فاصله خطوط 50 سانتیمتر کشت گردید. کرتهای آزمایشی با یک خط نکاشت از همدیگر جدا شدند. میزان بذر مصرفی بر مبنای 25 کیلوگرم در هکتار محاسبه شد و در هر خط 6 گرم و مجموعاً در هر واحد آزمایشی 30 گرم بذر مصرف گردید. صفات مورد ارزیابی شامل ارتفاع بوته (سانتیمتر)، محتوای کلروفیل برگ، وزن تر کل (گرم)، وزن خشک کل (گرم)، وزن تر برگ (گرم)، وزن خشک برگ (گرم)، وزن تر ساقه (گرم)، وزن خشک ساقه (گرم)، تعداد برگ، تعداد ساقه، نسبت تعداد برگ به تعداد ساقه، نسبت وزن خشک برگ به وزن خشک ساقه و نسبت وزن خشک کل به وزن تر کل بود. تمام اندازه گیری   ها در مرحله رسیدن به 10% گلدهی انجام شد. میزان کلروفیل با دستگاه SPAD520 مدل Minolta Co اندازه گیری شد. برای اندازه گیری ارتفاع نمونه ها از هر تکرار پنج گیاه انتخاب و در مجموع ارتفاع 15 گیاه اندازه گیری شد. برای اندازه گیری وزن تر از هر تکرار دو گیاه و در مجموع شش گیاه از هر جمعیت از قسمت طوقه جدا شده و پس از اندازه گیری وزن کل شش بوته، برگها جدا شده و وزن برگ و ساقه جداگانه اندازه گیری شد. برگ ها و ساقه ها برای مدت 72 ساعت در آون 72 درجه سانتیگراد قرار داده شدند و سپس وزن خشک برگ و ساقه محاسبه گردید. محاسبه تابع تشخیص کانونیکی بصورتی انجام می گیرد که نسبت شاخص اختلاف بین گروه ها به شاخص اختلاف درون گروه ها، حداکثر گردد (Rencher، 2002). به این ترتیب متغیر کانونیکی به دست می  آید که ضرایب آن مقادیر بردار ویژه ماتریس W^-1B است که W ماتریس مجموع مربعات درون گروهی و B ماتریس مجموع مربعات بین گروهی نمونه ها می باشد (Rencher، 2002). تفاوت بین مقدار مرکزی دو گروه برابر با فاصله ماهالانوبیس (D²) است و بصورت زیر محاسبه می شود.

D²= (Ῡ₁ - Ῡ₂)^' S^-1 (Ῡ₁ - Ῡ₂)

که در آن S^-1 معکوس ماتریس واریانس کوواریانس نمونه است و Ῡ₁ و Ῡ₂ به ترتیب بردارهای میانگین صفات اندازه گیری شده گروههای 1 و 2 است (Rencher، 2002). تجزیه کلاستر با نرم افزار SPSS 19.0 انجام گرفت. دندروگرام به روش حداقل واریانس  وارد (Ward) و پس از استاندارد کردن داده ها بر اساس میانگین صفات برای هر جمعیت، ترسیم گردید. پس از برش دندروگرام صحت گرو ه بندی اولیه به دست آمده از تجزیه کلاستر با تابع تشخیص مورد ارزیابی قرار گرفت. همچنین تجزیه تشخیص کانونیک نیز به وسیله نرم افزار SAS 9.0 انجام گرفت.

جودل 1--------------------

نتایج و بحث

بر اساس نتایج تجزیه کلاستر به روش حداقل واریانس وارد و معیار مربع فاصله اقلیدسی جمعیت های مورد بررسی در سه گروه مجزا قرار گرفتند (شکل 1) و به منظور صحت گروهبندی های به دست آمده از روش تجزیه کلاستر از تابع تشخیص به روش کنار گذاری (Hold out) استفاده گردید. نتایج گروه بندی تابع تشخیص در جدول 1 آمده است. تابع تشخیص نشان داد که تمامی جمعیت ها بطور صحیح گروه بندی شده اند و میزان موفقیت کل تابع تشخیص 100 درصد بود. این مقدار را میزان موفقیت کل تابع تشخیص می گویند. میزان موفقیت نشان می دهد که تابع تشخیص تا چه حد در گروه بندی یا تشخیص بین گروه ها موفق بوده است (صفری و همکاران، 1387).

جدول 1 شکل 1

صفری و همکاران (1387) نیز در تحقیقی که بر روی داده های مزرعه ای بادام زمینی انجام دادند، ژنوتیپ های مورد مطالعه را در سه گروه دسته بندی کردند و با استفاده از تجزیه تابع تشخیص نشان دادند 100 درصد از گروه بندی ها صحیح انجام گرفته بود. ولی در تحقیق دیگری که توسط جینز و همکاران (Jaynes و همکاران، 2003) بر روی ذرت انجام شد، ژنوتیپ های مورد بررسی در 5 گروه دسته بندی شدند و نتایج تابع تشخیص نشان داد که 80 درصد از گروهبندی ها صحیح انجام گرفته بود. در تجزیه تشخیص کانونیکی دو متغیر کانونیک اول معنی دار بودند (0001/0>p) (جدول 2). هر متغیر کانونیکی، ترکیب خطی مجموعه متغیرهای پیش بینی کننده و متغیرهای مجموعه اندازه گیری شده را محاسبه می کند (Vaylay و Van Santen، 2002). همبستگی های کانونیکی معنی دار بین جمعیت ها با اولین متغیر کانونیک (916/0=Rc) و دومین متغیر کانونیک (801/0=R_c) نشان دهنده این است که متغیرهای کانونیک تفاوت بین جمعیت ها را به خوبی توجیه می کنند (جدول 2).

جدول 2--------------

ضرایب تشخیص استاندارد شده کانونیکی، همبستگی خطی ساده بین متغیرهای اصلی و متغیرهای کانونیکی را محاسبه می کند. لذا ضرایب تشخیص استاندارد شده کانونیکی منعکس کننده واریانس مشترکی است که متغیرهای اندازه گیری شده با متغیرهای کانونیک دارند و می تواند در ارزیابی توجیه نسبی هر متغیر در هر معادله کانونیک مورد تفسیر قرار بگیرد (Cruz-Castillo و همکاران، 1994). رنچر نیز توصیه می کند که برای تفسیر توابع تشخیص از ضرایب تشخیص استاندارد شده استفاده شود (Rencher، 1992). این ضرایب تأثیرات و سهم هر صفت (متغیر) را پس از حذف اثرات سایر صفات در توابع تشخیص بدست می دهد و در واقع می توان گفت که اثرات خالص هر صفت را در تابع تشخیص محاسبه می کند. ضرایب استاندارد شده کانونیکی صفات وزن خشک برگ، وزن خشک کل، وزن تر کل، وزن تر برگ و وزن تر ساقه در اولین معادله تشخیص کانونیکی قابل توجه است (جدول 2). همچنین ضریب صفت ارتفاع بوته در دومین معادله تشخیص کانونیکی زیاد است (جدول 2). این نتایج حاکی از این است که این صفات بیشترین تاثیر را در تنوع بین جمعیت های مورد مطالعه دارند و به عبارتی سهم بیشتری از تنوع بین این جمعیت ها بر اساس این صفات قابل توجیه می باشد.

از متغیرهای کانونیکی معنی دار اول و دوم برای گروه بندی جمعیت ها استفاده شد (شکل 2). همان طور که در شکل 2 مشاهده می شود، 3 گروه کاملاً مجزا بدست آمد و فواصل این گروه ها به وسیله فاصله ماهالانوبیس محاسبه شد که در جدول (3) آمده است. همه جفت فواصل بین گروه ها معنی دار بودند (0001/0>p). هر گروه تنوع ژنتیکی درون گروهی کمی نسبت به تنوع بین گروهی دارد و در حقیقت جمعیت های داخل یک گروه فاصله ژنتیکی کمتری با یکدیگر دارند. گروه اول شامل 5 جمعیت (جمعیت های همدانی، قره یونجه ارومیه، قره یونجه ملک کندی، آذربایجان اردوباد و ترکیه 1) از 8 جمعیت مطالعه شده است، گروه دوم دارای یک جمعیت (جمعیت محلی اصفهانی) و گروه سوم دارای 2 جمعیت باقیمانده (جمعیت های ترکیه ساکوئل و بغدادی) است.

شکل 2 جدول 3-------------

به منظور مقایسه میانگین گروه ها از نظر صفات مورد ارزیابی، بعد از تجزیه واریانس بر اساس طرح کاملاً تصادفی نامتعادل به طوریکه گروه ها به عنوان تیمار و جمعیت های درون آنها به عنوان تکرار منظور گردید، از روش حداقل دامنه معنی دار (دانکن) استفاده شد. البته با توجه به اینکه گروه دوم شامل فقط یک جمعیت (جمعیت محلی اصفهانی) بود لذا برای انجام تجزیه واریانس از داده های کل ژنوتیپ های مربوط به جمعیت ها که هر جمعیت شامل 10 ژنوتیپ بود، استفاده شد که نتایج حاکی از تفاوت معنی دار بین گروه ها برای تمامی صفات به جز صفات محتوای کلروفیل برگ، نسبت وزن خشک برگ به وزن خشک ساقه و نسبت وزن خشک کل به وزن تر کل بود (جدول 4).

میانگین صفات اندازه گیری شده برای هر گروه در جدول 5 آورده شده است. جمعیت های گروه بندی شده در کلاستر سوم دارای بالاترین ارتفاع بوته، وزن تر کل، وزن خشک کل، وزن تر برگ، وزن تر ساقه، وزن خشک ساقه، وزن خشک برگ، وزن تر برگ، تعداد برگ و تعداد ساقه بودند. که با توجه به اهمیت این صفات در عملکرد علوفه یونجه به نظر می رسد در این خصوص جمعیت های موجود در این کلاستر از اهمیت بالاتری برخوردار باشند. لازم به ذکر است که صفات ذکر شده، دارای ضرایب کانونیکی بزرگی نیز در متغیرهای کانونیک بودند (جدول 2). ژنوتیپ های مربوط به جمعیت های درون این گروه با وجود عملکرد بالا به دلیل فاصله ژنتیکی کم، بهتر است با همدیگر تلاقی داده نشوند و در برنامه های به نژادی جهت ایجاد رقم هیبرید جهت حصول حداکثر هتروزیس بهتر است از افراد مربوط به جمعیتهایی که در گروه های متفاوت و دارای فاصله بیشتر (گروه 2 و 3 در این تحقیق) هستند، استفاده گردد. همچنین در گروه های با حداکثر فاصله از جمعیت های مربوط به این گروه ها که خود حداکثر فاصله ژنتیکی را نشان می دهند، نیز می توان به عنوان والدین هیبریدها بهره برد.

جدول 5------

بطور کلی نتایج این تحقیق نشان می دهد که بین جمعیت های مورد مطالعه تنوع ژنتیکی معنی داری وجود دارد که حاکی از ارزشمند بودن این ذخایر و لزوم توجه بیشتر در حفظ، نگهداری، ارزیابی و شناسایی آنهاست و همچنین برخی از جمعیت ها و ژنوتیپ های مربوط به آنها با داشتن توان تولید بالا و یا صفات مطلوب دیگر می توانند در برنامه های به نژادی مورد استفاده قرار بگیرند و منشأ تولید ارقام اصلاح شده باشند. تجزیه تشخیص کانونیکی نیز در محاسبه میزان تنوع و شناسایی صفات بسیار موثر در تنوع بین جمعیت های یونجه زراعی مورد بررسی موفق عمل کرد. صفات مؤثر شناسایی شده در تنوع بین جمعیت ها شامل وزن خشک برگ، وزن خشک کل، وزن تر کل، وزن تر برگ و وزن تر ساقه و همچنین ارتفاع بوته می باشند. تشخیص تنوع این صفات بین جمعیت های یونجه زراعی به اصلاحگر این اجازه را می دهد تا بر صفات مشخصی که موجب تنوع شده است، تمرکز کند. مسلماً استفاده از نشانگرهای ملکولی مختلف همراه با نشانگرهای مورفولوژیک جهت شناسایی چنین تنوعی در ژرم پلاسم یونجه های مطالعه شده بطور مؤثر و کاراتری می توانند در مدیریت نگهداری ژرم پلاسم ها و همچنین در شناسایی جمعیت های مناسب برای اهداف اصلاحی مختلف مفید باشند.